mRNA实时荧光定量PCR(qPCR)

吉田生物mRNA实时定量PCR技术服务流程

一、相对定量

1. 设计并合成Realtime PCR引物
2. 引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶进行含SG(SYBR® Green)的PCR反应的优化。
3. RNA抽提
    a. 若实验对象为组织样品,取适量(50-100mg)新鲜组织样品或正确保存的组织样品,加1ml的RNA抽提试剂Trizol(Invitrogen),匀浆后抽提RNA。
    b. 若实验对象为细胞样品,每份样品取1×106~1×107细胞,完全吸去培养液后加1ml的RNA抽提试剂Trizol(Invitrogen),裂解后抽提RNA。
4. RNA质量检测
   
a. 紫外吸收测定法测定RNA在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,以计算其浓度并评估RNA纯度。
    b. 使用甲醛电泳试剂(ambion)进行变性琼脂糖凝胶电泳,检测RNA纯度及完整性。
5. cDNA合成
   
 按照逆转录酶(Invitrogen或Promega)5. 使用说明将样品RNA逆转录为cDNA。
6. 制备标准曲线样品(可选)
    进行相对定量,需要先将样品的目的基因以及管家基因进行PCR扩增, 其产物进行梯度稀释用于做标准曲线。
7. 实时定量PCR
   
 标准曲线样品和待测样品分别加入到含SG的RealTime PCR反应液中(其中TaqBead热启动聚合酶来自Promega公司),进行RealTime PCR扩增和检测
8. 数据分析
   
检测结果进行标准曲线分析,以对待测样品的目的基因进行定量。相对定量实验需要进一步用样品的目的基因测得值除以管家基因测得值以校正误差,所得结果代表某样品的目的基因相对含量。
9. 提供实验报告包括详细的实验方法及实时荧光定量PCR实验结果及相关图表。

DNA/RNA提取 80元/样

逆转录 80元/样

引物设计与实验验证 150元/对(提供验证成功引物及序列,第二次检测免收)

qPCR(三次重复SYBR Green1法):

样本数<20     100元/样

样本数20-100   80元/样

样本数>100     60元/样

二、绝对定量

服务内容:

使用的SYBR荧光染料法,依托ABI7500定量PCR系统,提供实时荧光绝对定量PCR技术服务。

1. 根据客户提供基因序列设计标准品;

2. 根据标准品绘制标准曲线
3. Real-Time PCR,进行扩增曲线、溶解曲线、实验结果分析。

4. 提供完整的实验报告。

报告内容

1. 完整的实验过程报告;
2. 数据分析结果(发表级图片形式)。

收费标准

荧光定量PCR标准曲线绘制




服务项目

实验说明

实验周期

实验报价

标准质粒构建

基因合成或PCR克隆法构建

1周

500元

标准曲线绘制

选择6个浓度梯度绘制标准曲线

2个工作日

600元

进行绝对定量PCR的实验,需委托吉田生物构建标准品质粒,以标准质粒构建标准曲线(选6个浓度梯度,3次重复)



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