免疫荧光双标记

 免疫组化双重染色方法

在生物医学和临床研究实践中,经常需要检测两种不同物质是否在同一样品中共存或同一种细胞中共存,需要采用免疫组织化学双重染色。


用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞,洗去多余的第一抗体后,再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞,洗去多余的第二抗体,后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察,从而对两种抗原进行定位和定量。使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属,且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。

免疫荧光双染protocol (以ISL1和Scp3双染为例)
动物组织采集后用4%PFA固定, 脱水浸蜡, 用石蜡包埋成块。
用石蜡切片机把包埋好的组织切成5 μm厚的蜡带, 浮在40℃水浴展开, 用APES裱过的载玻片捞起, 使组织切片平整的贴在载玻片中央, 置于37 ℃烘箱过夜, 使组织切片牢固贴附在载玻片上。
烤好的切片放在二甲苯中浸泡两次, 每次10 min, 脱去组织中的蜡。
脱完蜡的切片依次放入100%、95%、70%、50%的酒精和蒸馏中水中各5 min。
把切片放入TCA溶液中, 用微波炉高火煮沸, 再用低火维持溶液沸腾 (每隔4 min补水一次, 共4-8次), 然后让其自然冷却至室温, 使抗原充分暴露。
用10%的正常羊血清在室温下孵育1 h, 封闭组织上非特异性结合抗体的位点。
加入1: 50稀释的鼠抗ISL1单克隆抗体40.2D6, 4℃ 孵育过夜后, 用PBS洗涤3×5 min;用PBS代替一抗作为阴性对照。
加入1: 50稀释的cy2标记的羊抗鼠荧光抗体 (GAM-cy2), 在常温下孵育2 h。
PBS洗涤3×5 min。
再次用10%的正常驴血清在室温下孵育1 h, 封闭组织上非特异性结合抗体的位点。
加入1: 100稀释的兔抗Scp3抗体, 常温孵育2 h;用PBS代替一抗作为阴性对照。
用PBS洗涤3×5 min。
加入1: 50稀释的cy3标记的驴抗兔荧光抗体 (DAR-cy3), 常温孵育2 h。
用含0.1%Tween20的PBS洗涤3×5 min。
滴加1:1000稀释的DAPI, 室温复染10 min。
PBS洗涤3×5 min。
用抗荧光衰减封片剂封片, 在荧光显微镜下同一视野下按顺序照相, 用蓝色激光激发, ISL1阳性信号为绿光, 拍摄后切换到绿色激发光, Scp3阳性信号为红光, 拍摄后切换到紫外激发光, DAPI染DNA后发蓝光。
同一视野下拍摄的三张图片在Photoshop中打开, 新建一张同样的图片, 把红、蓝、绿三种颜色分别拷贝到新建图片的红、蓝、绿三个颜色通道中, 合成荧光信号叠加的图片。

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