蛋白表达与纯化

一、大肠杆菌表达系统

实验原理

大肠杆菌蛋白表达系统是最长用也是经济实惠的原核蛋白表达系统。大肠杆菌蛋白表达系统主要具有以下特点:遗传背景清楚、易于培养和控制、转化操作简单、表达水平高、成本低、周期短、抗污染能力强、应用范围广泛等,是大部分科研工作者首选的表达系统。缺点主要是蛋白质翻译后缺乏加工机制,如二硫键的形成、蛋白糖基化和正确折叠。

针对于有些外源基因在大肠杆菌中重组表达会形成膜包裹的高密度、不溶性蛋白质的包涵体的情况,可以进行表达系统优化,尽量降低形成包涵体的几率。

可以提供His、GST、STREP、sumo、MBP等标签的特色融合蛋白的表达,His及STREP标签由6-8个氨基酸组成,对重组蛋白活性影响较小,GST、sumo、MBP标签可以促进目的蛋白的融合表达。目的蛋白在宿主细胞中可以进行低温诱导表达,大大提高了蛋白可溶表达的几率,增加了表达成功率和蛋白产物的活性概率。

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服务内容

1、密码子优化

涉及基因合成、载体构建等

2、载体构建和目的基因亚克隆

原核表达载体pET-15b,pET-28a,pGEX-6P-1,pRSFDuet和大肠杆菌表达宿主BL21,DE3等供挑选。

3、表达菌株的筛选及蛋白的小量诱导检测

4、优化蛋白的表达方案并大量表达和纯化蛋白

拥有先进的AKTA avant 25及AKTA avant avant 150系统和全套预装离子柱、分子筛、疏水柱和亲和柱。

5、内毒素检测和去除

 

服务标准及周期

步骤

实验内容

实验时间

备注

交付数据及材料

1

密码子优化(可选)

合成基因

1-2周

不同来源蛋白选择优化

1.基因合成报告

2

重组质粒构建

2   周

可选择不同载体,不同标签His, Trx , GST, SUMO…

2.测序验证报告

3.包含表达质粒的大肠杆菌DH5α

4.表达质粒

5.质粒说明书

3

重组表达测试

1周

不同表达菌株可选

6.阳性表达菌株

4

可溶性表达测试

l  转化

l  表达小试

l  表达分析鉴定

1-2周

不同诱导剂,诱导温度,也可重新考虑基于蛋白质
  结构点突变或者缺失突变的突变体构建

7.小试表达流程报告

8.小试表达分析原始图片

9.小试表达总结

5

小规模蛋白表达和纯化

l  蛋白亲和纯化(上清)

l  包涵体蛋白变复性

l  WB鉴定纯化后蛋白

l  PFM检测(可选)

l  MS检测(可选)

1-2周

若为包涵体表达,时间和方法将有所调整

 

10.蛋白纯化流程报告

11.蛋白纯化原始图片

12.发货蛋白

13.Western   Blot(标签抗体)

14.蛋白指纹图谱(可选)

15.蛋白质谱分子量(可选)

6

大规模蛋白表达和纯化

根据表达体积商定

可选择摇瓶或者发酵罐培养

蛋白纯度鉴定报告

成品蛋白

7

内毒素去除及检测

1周

可根据实验需求选择

内毒素含量测定报告

补充说明:

可根据实验需求选择上述任一实验内容,或相关实验内容的组合

纯化时选用亲和纯化、离子柱纯化、疏水填料纯化和分子筛纯化; 蛋白本身特性,表达系统的选择会影响最终蛋白的纯度和活性。

承接其他表达系统,详询。

二、酵母表达系统

三、昆虫细胞表达系统

四、哺乳动物细胞表达系统


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