细胞迁移/侵袭

划痕实验

实验内容:

1、用marker笔在6孔板背后,均匀地划横线,间距0.5~1cm。

2、在空中加入约5X10^5个细胞,具体数量因细胞而异,过夜能铺满即可。

3、第二天用枪头垂直于背后的横线划痕,枪头竖直直。

4、用PBS洗细胞3次,去除划下的细胞,加入无血清培养基。

5、放入37℃5%CO2培养箱培养。按0、6、12、24小时取样,拍照。

实验结果:

1. 细胞计数结果

2. 细胞显微照片

3. 实验报告(包括材料、仪器、操作流程、结果)。

收费标准:

1800元/6孔板

周期:

预付款后2-4周,视细胞培养情况。


The wound-healing assay is one of the earliest developed methods to studycell migration in vitro . This method is based on observation of cell migrationinto a “wound” that is created on a cell monolayer. Although not an exactduplication of cell migration in vivo, this method mimics to some extent migrationof cells in wound healing. 
In comparison with other popular in vitro methods, such as time-lapse microscopyand Boyden chamber assays, the wound-healing assay is particularly suitablefor studies of directional cell migration and its regulation by cell interaction with extracellular matrix (ECM) and cell–cell interactions. More recently, this assay also has been combined with microinjection or transfection to assess the effects of expression of exogenous genes on migration of individual cells (6–8). This is probably the simplest method to study cell migration in vitro and the only that requires commonand inexpensive supplies found in most labs that are capable of cell culturing.


Transwell检测迁移

 

细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究的细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

 

实验步骤:

 

1. 材料准备:


可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8μm,没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用),Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套,BD公司的Matrigel,无血清DMEM,(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基,DMEM完全培养基,1640完全培养基(也可加到20%血清),无菌PBS,棉签,胰酶,4%多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(0.1%(g/ml)PBS结晶紫)

 

2. 步骤和流程:


2.1基质胶铺板:


用BD公司的Matrigel 1:8(根据细胞产生mmp的量来决定)稀释,包被Transwell小室底部膜的上室面,置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。


2.2制备细胞悬液

 

①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12-24h,进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。


②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用PBS洗1-2遍),用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/ml。


2.3接种细胞


①取细胞悬液100µl加入Transwell小室。


②24孔板下室一般加入600µl含20%PBS的培养基,特别注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。


③培养细胞:常规培养12-48h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。24h较常见,时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外,处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。


2.4结果统计


直接计数法,“贴壁”细胞计数,这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后,可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去,通过给细胞染色,可在镜下计数细胞。


1. 取出Transwell小室,弃去孔中培养液,用无钙的PBS洗2遍,甲醇固定30分钟,将小室适当风干。


2. 0 .1%结晶紫染色20 min,用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞,用PBS洗3遍。


3. 400倍显微镜下随即五个视野观察细胞,记数。

 

实验结果:

1. 细胞计数结果

2. 细胞显微照片

3. 实验报告(包括材料、仪器、操作流程、结果)。

收费标准:

3000元/6孔板

周期:

预付款后2-4周,视细胞培养情况。

 

 

 Transwell检测侵袭

 

transwell侵袭实验就是用一层膜将高营养的培养液和低营养的培养液隔开,细胞放在低营养的培养液里,细胞会往高营养的培养液方向移动。应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

 

实验内容:

 

(1)共培养体系:


小于3.0um孔径条件下,细胞不会迁徙通过,因此,若研究不涉及细胞运动能力,不需要细胞穿过聚碳酸酯膜,则应选择3.0µm以下孔径。常用0.4、3.0µm。我们实验室用的是0.4µm。将细胞A种于上室,细胞B种于下室,可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。


(2)趋化性实验


 可用5.0、8.0、12.0µm膜,上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室,计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。
 ①细胞B对细胞A的趋化作用:将细胞A种于上室,细胞B种于下室,可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。
 ②趋化因子对细胞的趋化作用:将细胞种于上室,下室加入某种趋化因子,可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。


(3)肿瘤细胞迁移实验


 常用8.0、12.0µm膜,上室种肿瘤细胞,下室加入FBS或某些特定的趋化因子,肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑,计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。


(4)肿瘤细胞侵袭实验常用8.0、12.0µm膜,原理与肿瘤细胞迁移实验类似。

 

在聚碳酸酯膜上涂上一层基质胶,模仿细胞外基质,上室种肿瘤细胞,下室加入FBS或实验设定的药物或者影响因子,细胞会分泌相关酶类消化模拟细胞外基质膜的基质胶,从而从上室迁移到下室,通过计数进入下室的细胞量测定细胞的侵袭能力。

实验结果:

1. 细胞计数结果

2. 细胞显微照片

3. 实验报告(包括材料、仪器、操作流程、结果)。

收费标准:

3000元/6孔板

周期:

预付款后2-4周,视细胞培养情况。


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