基因敲除常见问题与解答

基因敲除常见问题与解答

一、什么是ES细胞显微注射? 
答:胚胎干细胞显微注射是制作基因敲除小鼠的一个最常用的方法。主要过程是将携带目的基因的胚胎干细胞注射到小鼠的囊胚腔中获得嵌合体小鼠。所得嵌合体小鼠的组织,将同时含有来源于囊胚的细胞和胚胎干细胞。嵌合体小鼠必须和野生型小鼠配种以决定遗传改变的生殖系能否传递,这样可能获得转基因或打靶基因(来源于胚胎干细胞)稳定的生殖系传递的小鼠。一般情况下,大约能获得50%继承了目的基因的后代。

二、嵌合体 
遗传学上用以指不同遗传性状嵌合或混杂表现的个体。免疫学上的涵义则指一个机体身上有两种或两种以上染色体组成不同的细胞系同时存在,彼此能够耐受,不产生排斥反应,相互间处在嵌合状态。在基因敲除鼠中指通过向囊胚注射被外源基因转化了的胚胎干细胞,使得发育成为的个体中含有不同基因型的细胞,产生的个体也叫嵌合体,即该生物体中嵌合了两种不同遗传结构的细胞(一种是基因型被改变了的细胞,另一种是原来的基因型的细胞)。

三、条件性敲除的原理? 
答:Cre-LoxP系统是源于P1噬菌体的一个DNA重组体系,由Cre酶和相应的LoxP位点组成,它能导致重组发生在特定的DNA序列处(LoxP位点),该系统可以将外源基因定点整合到染色体上或将特定DNA片段删除。基于Cre-LoxP的基因打靶要分两步来进行。首先要在胚胎干细胞的基因组中引入LoxP序列,这一步可以通过打靶载体的设计和对同源重组子的筛选来实现。下一步通过Cre介导的重组来实现靶基因的遗传修饰或改变。Cre-LoxP系统既可以在细胞水平上用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞,通过识别LoxP位点将抗性标记基因切除,又可以在个体水平上将重组杂合子小鼠与Cre转基因小鼠杂交,筛选子代小鼠就可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠。

四、如何鉴定和挑选嵌合体? 
答:动物只有部分组织细胞整合有外源基因,则称为嵌合体动物。它的鉴定主要根据毛色去鉴定。注射的ES和囊胚来源不同的小鼠品系。它们的毛色不同。因此可以根据毛色的嵌合率来鉴定和挑选嵌合体。

五、ROSA26与定点插入? 
答:利用同源重组技术,把外面的cDNA片段或者其他DNA片段,定点插入到ROSA26位置。ROSA26是一个安全区域,外源性的基因定点插入这个位点不会影响其他基因的表达。

 


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